分子诊断中PCR和mNGS在传染病诊断领域的应用
分子诊断技术主要分为PCR技术、原位杂交技术、核酸质谱及基因测序。而在传染病检测领域，PCR技术和基因测序应用更加广泛。
1）PCR技术检测速度快，市场份额大。在传染病的诊断和血筛方面，基于PCR技术的分子诊断能缩短诊断的窗口期，并且可以定量对病原体进行检测。相比于传统的免疫诊断方式而言，有不可替代的优势。所以，基于PCR的分子诊断往往是医院对传染病诊断的最后“金标准”也是应用最广泛的分子诊断技术，占据最大的市场份额。
2）NGS通量大，效率高，正在高速发展并不断占据市场份额。基因测序目前已进入二代测序（NGS）时代。NGS拥有高通量、无需培养、高敏感度、能够鉴定未知病原体及罕见病原菌等优势，在传染病的预防和控制中发挥着重要作用。
PCR诊断
1、现状
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，利用DNA在体外摄氏95°C高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5′-3′)的方向合成互补链。PCR诊断就是基于PCR技术完成病原体基因片段的扩增，从而确定样本中病原体的存在，实现患者的确诊。
PCR技术易操作，临床应用程度高。从PCR技术发明至今已过30年，而PCR技术也发展到第三代。PCR技术在医学检验学中最有价值的应用领域就是对传染性疾病的诊断，既可以选择病原体基因中的保守区做通用检测，也可以选定差异较大的基因部分做分型检测，而且检测的灵敏度和特异性都远远超过当前的免疫学检测方法，所需时间也可达到临床要求，尤其适用于难以培养的病毒、细菌和原虫等。目前主要运用的是第二代和第三代PCR技术。1）第二代PCR。第二代PCR就是荧光定量PCR技术（Real-Time PCR），也叫做qPCR。荧光定量PCR通过在反应体系中加入能够指示反映进程的荧光探针，通过荧光信号的积累来监测扩增产物的积累。目前常用于传染性疾病病原体检测、疾病耐药基因研究等方面。该技术操作流程更简单，经济高效，需要的DNA和RNA加样量少，不过也存在易污染的问题，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。如本次疫情中研发的试剂盒就有部分使用了PCR技术，根据检测结果来看，也有部分试剂盒出现了假阳性的反应。2）第三代PCR。第三代PCR技术叫做数字PCR（Digital PCR, dPCR, Dig-PCR），这是目前全新的一种PCR检测方式，能对核酸进行检测和定量，采用直接计数目标分子而不依赖任何校准物或者外表，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。相较于二代技术，数字PCR灵敏度更高，定量更准确，抗干扰能力更强，但是对模板质量和引物特异性要求较高。目前数字PCR技术可用于检测病毒感染和细菌、HIV病毒潜伏库监测、残留病毒载量等。
2、市场规模
感染性疾病领域临床需求稳定，PCR诊断规模达十亿级别。根据火石创造的统计数据，近年全球分子诊断行业年均增速约为11%，而我国分子诊断行业年均增速则达到了24%，为全球增速的两倍。PCR作为分子诊断极其重要的组成部分，由于临床需求推动PCR诊断稳步放量，预计2021年市场规模达53.4亿元。根据测算，基于PCR平台的感染性疾病发病人数有望从2017年555.30万人/年增加到2021年的577.84万人/年，应用PCR平台产生的诊断费用有望由2017年的13.88亿元增加到2021年的14.45亿元。在血筛方面，根据卫计委相关数据，全国无偿献血人次从1998年的5万人次增长到 2013 年的1278万人次，增长了近256倍。由于艾滋病、肝炎等传染病主要通过血液传播，受血者一旦输入了感染了病毒的血液，被感染的概率接近100%，危害性极高，因此对血液安全检测拥有强烈的刚性需求。我国开始于2010年的血站系统核酸检测（NAT）试点工作将在未来继续推广，根据我国的献血人次，至少将带来每年1200万人份左右用于血源筛查的核酸检测试剂市场需求。基于PCR平台的血筛市场规模有望由2017年的4.09亿元增加到2021年的6.21亿元。
3、竞争格局
PCR仪器市场目前仍由国际厂商主导。在三级医院高端PCR仪器市场中，国际厂商仍占据主流。国内市场上约有PCR仪器厂商数十家，进口品牌包括赛默飞、伯乐、罗氏等，国产厂商则包括西安天隆、杭州郞基、珠海黑马、杭州博日、上海领成等，进口品牌约占市场总量的70%以上。国外代表企业的PCR仪器价格每台在3万元到9万元之间，国内企业获批的PCR仪器主要在技术水平要求相对较低的核酸提取/纯化仪及PCR扩增仪领域，价格则每台在2.6到2.8万元之间，国产PCR仪器具有明显的价格优势，因此国产PCR仪器在二级及以下医院布局具有很大优势。
PCR试剂基本实现国产化，国内多家企业布局PCR产品。PCR试剂可分为核酸提取试剂及核酸诊断试剂，由于PCR检测系统多为开放式，试剂研发技术门槛较仪器低，国内厂商凭借在价格及渠道方面的优势，PCR试剂已基本实现国产化。目前针对常见传染病的检测，如乙肝、丙肝、艾滋病等，多家国产企业研发了试剂盒，包括华大生物、之江生物、圣湘生物、迈克生物等企业，国内生产厂家数均远大于国外厂家。甲型、乙型、丙型流感等常见疾病的核酸检测试剂盒也已经比较成熟，竞争厂家较多，几乎全部为国产品牌。
mNGS
1、现状
mNGS是感染性疾病诊断的重要技术。对于基因测序而言，其对于病原体的筛查，不仅限于传染性疾病，而是在整个感染性疾病范围（感染性疾病包括传染病以及其他不具备传染性的病原体感染性疾病）。感染类疾病的检测重点在于检出率、时效性、功能指标分析和对于未知病原的快速定性分析能力，传统检测手段存在病原体培养周期长、成功率低、功能指标分析能力不足和难以做到广谱检测的缺点，而基因测序则为解决这些问题提供了一个新的途径。目前主流的基因测序技术是二代测序(Next-generation Sequencing ,NGS)，当NGS技术用于感染性疾病检测时，NGS会测出样本中所有的微生物，而不是像PCR那样只有单一靶标，同时也无需提前获悉待测病原体的序列信息，所以此时NGS也被称为mNGS（meta-genomics NGS）。
基因测序检测范围广，效率高，在传染病检测中mNGS为主流技术。目前，基因测序平台已经出到了第三代，但是三代测序准确率仍然不够高，成本也较高昂，因此NGS仍然是主流。目前mNGS使用的技术中以罗氏公司的454技术、Illumina公司的Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为代表。
2、市场规模
mNGS市场规模大，行业仍处于发展期。据WHO对2015年全球死亡原因统计，全球因感染死亡的人数将近1000万，占全部死亡原因的17%。根据亿欧网的数据，目前美国感染类疾病的诊断市场总规模为180亿美金，预计在2022年基于mNGS的感染类疾病诊断市场将达到50亿美元。根据IMS公司的数据，在我国感染性疾病的发病率为120-250人/10万人，微生物送检量约5000万份，其中血培养约4000万例/年，肺泡灌洗液BALF约100万例/年，脑脊液及其他体液约50万例/年。另外，随着肿瘤患者生存期显著增长，超过30%肿瘤患者死于复杂感染。基于以上数据，当检测价格降至2000-2500元区间，目标市场检测量保守估计为500万份/年，约为100亿人民币。mNGS的高通量和广覆盖性使得其在混合感染和未知致病微生物的检测方面具有巨大优势。2019年复旦大学附属中山医院的胡必杰团队研究结果显示，mNGS具有更高的病原体鉴定灵敏度，受抗生素的影响较小，因此具有检测传染疾病的潜力及临床意义。因此，可以预计mNGS拥有巨大的潜在市场。
3、竞争格局
多家企业布局，行业发展态势良好。mNGS在2014年第一次在临床上成功应用于病原体的诊断，行业发展历史较短，但是mNGS已经受到业内关注，在各种展会和学术会议上都能看到mNGS的宣传和讨论，布局 mNGS的企业也日渐增多。国外代表公司有IDbyDNA、Karius，国内公司有华大基因、博奥生物、达瑞生物、赛哲生物、微远基因、金域医学、金匙基因等数十家企业，行业发展势头火热。不过关于mNGS在微生物领域的应用，目前全球还没有相关领域的注册试剂获批。国外是通过LDT的方式开展,国内目前处在方法学的标准品验证阶段，由中检院负责，华大基因、博奥生物、达瑞生物和赛哲生物四家公司是第一批参与标准品验证的公司。其中华大基因用自己的BGISEQ测序平台，博奥生物、达瑞生物两家用Thermo Fisher的NGS平台，赛哲生物用的是Illumina平台。
化学发光、PCR与mNGS在传染病诊断领域相辅相成
1、化学发光
从便捷程度而言，化学发光相比分子诊断整个检测过程耗时更短，价格更低，并且化学发光仪器相比分子诊断仪器在医院中的普及度更高。如目前医院术前八项检查较多的使用化学发光技术，其价格远低于使用分子诊断方法，灵敏度可达到要求，检测得到结果的速度也更快。
从应用范围来讲，由于化学发光应用免疫诊断原理测血清样本中的特异性抗原，其原理决定着化学发光无法被分子诊断替代：1）从取样而言，化学发光取得是血清样本可避免取其他样本的操作不规范问题。对于比如新冠病毒等下呼吸道感染疾病而言，化学发光可避免核酸检测中由于取样困难及不规范而导致的假阴性问题。2）传染病疫苗的抗体检查，仅可使用免疫诊断的方法。如乙肝疫苗的有效期是五年。由于每个人的身体状况不一样会导致乙肝抗体存活时间不同，因此再次接种乙肝之前需做乙肝病毒抗体检测，还可检查抗体滴度，这时化学发光的诊断方法成为了最佳选择。
然而化学发光基于免疫的原理也有一定的局限性：比如其要求被检测的抗原或抗体具有特异性，而往往人体内出现特异性抗体时，患者已经患病较长时间，传染病患者可能在不知情时已经完成疾病对于周围人群的传播，因此该诊断手段对于早期传染病患者的确诊可能无法起到太大作用，对于传染病的早期发现和遏制作用也有限，往往更适用于已表现出明显症状的患者的确诊。
2、PCR
从便捷程度而言，PCR的整个检测过程耗时（样本采集、预处理、上机检测、报告）过程介于化学发光和mNGS之间，价格也相比mNGS要低的多，灵敏度相比化学发光或较高。此外对于本身拥有PCR实验室的医院，在二者皆可选的情况下，或更有动力做PCR检测而非将mNGS检测外包。
从应用范围来讲，PCR技术相比化学发光或拥有更多优势：1）分子诊断更适用于传染病早期的大规模确诊。理论上，只要样本有一个病原体存在，PCR就可以检测到。PCR对病原体的检测解决了免疫学检测的“窗口期”问题，可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。因此，考虑到传染病防治的关键点之一在于早期对于疾病的迅速确诊，PCR技术更适用于传染病早期的大规模确诊，可以克服免疫诊断的滞后性和基因测序的复杂性。在本次新型冠状病毒肺炎疫情中，通过NMPA审批的试剂盒也以PCR试剂盒为主。2）分子诊断可对病毒分型。如目前HPV诊断主要应用PCR技术，PCR可以鉴定特殊的HPV型别以及变异株，并对其进行针对性的处理，更有效预防宫颈癌。3）PCR可确定病毒载量。在抗病毒药物治疗监测的过程中，病毒载量是判断药物疗效的重要指标。如HIV的药物载量测定需通过PCR来测定血液中HIV RNA的量，通过药物载量的高低变化可帮助判断HIV药物效果。
PCR有一定的局限性：将PCR技术运用于传染病的临床检测也容易出现假阳性和假阴性的问题，原因就在于样本可能受到污染或者检测过程中操作不当。因此，PCR诊断要求在高标准的实验室条件下进行，以此提高检测结果的准确性。
3、mNGS
mNGS拥有具有无需预先培养样本、灵敏度高、高通量等优势，未来发展前景非常广阔。但与此同时，由于起步晚，目前有着价格贵、普及度低等问题。
从应用范围来讲，mNGS对新发的、疑难的感染病能够指明方向：1）mNGS检测覆盖范围广。相较于病原学诊断与常规的培养，mNGS没有偏移性，即不会由于标本中存在多种病原体而导致病原学诊断的偏移性，检测范围覆盖广，可以同时培养多种病原体，效率高。因此mNGS在确诊混合感染病人病原体和在常规实验室检查中未能发现病原体的患者的治疗上具有优势，不仅可以用于新型传染病早期大规模爆发时迅速完成病原体基因测序，鉴定新的病毒株，促进有效药物和疫苗的探索和研发，也可用于早期低病毒含量样本的检测或实时荧光RT-PCR检测可疑或灰区结果的确认。2）mNGS可以弥补RT-PCR的缺点，并能监测病毒传播过程中可能的变异，同时对于部分病毒含量较低的样本，mNGS可以提高检测阳性率。3）mNGS也可以在病原培养后做深度的二代测序，甚至全基因组分析，为预防以后同类型传染病的爆发积累经验。
不过，mNGS技术目前有一定限制：在检测过程中，样本容易受到人源干扰，导致检出率下降，而且mNGS的技术原理决定了它只能先测序后分析，所以上机测序这一步的时间开销始终无法跳过，导致该项技术的时效性打了折扣。
4多种手段互相补充，提高检测效率和准确性
传染病的检测和治疗往往不是一个短暂的过程。上述提到的检测手段各有其优缺点，目前尚未有一种检测手段在成本、耗时、准确度等方面都占据优势，它们的适用阶段和范围也各有不同。但是毫无疑问，在整个传染病检测和防治的链条中，医生可以根据实际需要来选取合适的检测手段。如像本次传播速度极快的新冠肺炎就可以通过PCR诊断来迅速确定患者，完成密切接触者的隔离；但是PCR诊断假阳性时有发生，为了提高检测准确率，抗原和抗体检测试剂随后被研发出来，结合使用；NGS则被用来测定病毒基因序列，寻找有效药物、进行耐药性分析和疫苗研发。可见，传染病的检测和防治过程是紧密联系的，为了保证执行过程的高效性和准确性，多种检测手段的互相配合和补充是有必要的，或许未来随着技术的发展，某种检测手段可以取代其他手段，但是在近几年内，我们相信多种检测手段仍会并存，互相配合。
来源：广证恒生 作者：胡家嘉
编辑：As素 | 校对：Ryan | 责编：友凡
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